Es war der erste Raumflug eines Menschen in der Geschichte. Wostok startete vom Kosmodrom Baikonur. Die Landung von Juri Gagarin erfolgte nahe Smelowka nördlich von Usmorje (26 km südwestlich von Engels). Die leere Raumkapsel landete bereits um 07:48 UTC.

Während des Treffens einer staatlichen Kommission am 08. April 1961 stand die Auswahl des Kosmonauten im Mittelpunkt; die Nominierung Juri Gagarins wurde einstimmig angenommen. Außerdem wurden die Missionsdauer von einer Erdumkreisung sowie die Bahnhöhe von 180 bis 230 Kilometern bestätigt. Der letzte Zusammentritt der Kommission vor dem Start erfolgte am Morgen des 10. April 1961 und war in erster Linie eine Formsache für die sowjetische Presse. Am selben Tag wurde die Wostok-Trägerrakete zur Startrampe 1 gebracht, die zuvor schon für den Start des ersten Erdsatelliten Sputnik benutzt worden war. Darüber hinaus berechneten Ingenieure die exakte Startzeit (09:07 Moskauer Zeit am 12. April 1961 = 06:07 UTC).

Nachdem ein Tier während des Testprogramms Symptome der Raumkrankheit gezeigt hatte, wurde der Erstflug des Wostok-Raumschiffs auf einen Erdumlauf (Orbit) verkürzt. Des Weiteren wurden mehrere Notfallprozeduren entwickelt, die die Sicherheit des Kosmonauten gewährleisten sollten. So wählte man für das Raumschiff beispielsweise eine Umlaufbahn, die im Falle einer Fehlfunktion der Bremstriebwerke einen natürlichen Wiedereintritt nach zwei bis sieben Tagen gewährleistet. In der Kapsel befanden sich außerdem ein Vorrat an Wasser und Nahrung für zehn Tage sowie ein Sender, mit dem die Landestelle des Raumfahrers bestimmt werden konnte. Falls die Landung auf nichtsowjetischem Boden erfolgen würde, war der Kosmonaut laut einer Mitteilung an das Zentralkomitee der UdSSR mit „angemessenen Instruktionen“ ausgestattet. Die bemannte Variante des Wostok-Raumschiffs besaß keinen Selbstzerstörungsmechanismus.

Die Nacht auf den 12. April 1961 verbrachte Juri Gagarin zusammen mit seinem Ersatzmann German Titow in einer Holzhütte in der Nähe des Startgeländes. Beide Männer trugen Sensoren an ihrem Körper, die die wichtigsten Vitalfunktionen für die Flugärzte überwachten.

Um 05:30 MST (02:30 UTC) wurden Juri Gagarin und German Titow durch den Luftwaffenarzt Jewgeni Karpow geweckt, worauf ein kurzes Frühstück und eine letzte medizinische Untersuchung folgten. Anschließend legten sich beide mit der Hilfe zweier Assistenten ihre SK-1-Raumanzüge an. Die mehrlagigen, orangefarbenen Garnituren wogen rund zehn Kilogramm und sollten den Raumfahrer vor einem möglichen Druckverlust schützen. Gegen 06:30 MST (03:30 UTC) bestiegen Juri Gagarin und German Titow zusammen mit den Kosmonauten-Anwärtern Grigori Neljubow und Andrijan Nikolajew den Bus, der sie die kurze Strecke zur Startrampe brachte. Bei seiner Ankunft berichtete Juri Gagarin gegenüber dem Vorsitzenden der staatlichen Kommission, Konstantin Rudnew, in Kürze, dass er für die ihm zugewiesene Mission bereit sei. Danach brachte ihn ein Aufzug an die Spitze der Wostok-Rakete, wo er durch eine Luke das Raumschiff bestieg.

Um 07:10 MST (04:10 UTC) aktivierte Juri Gagarin das Funkgerät, das ihn mit dem Konstrukteur Sergei Koroljow im Startkontrollzentrum verband. Juri Gagarin benutzte das Rufzeichen Kedr („Zeder“), während die Bodenstationen Sarja-1 („Morgenröte-1“) verwendeten. Um 07:50 MST (04:50 UTC), eine Stunde nach dem Einstieg Juri Gagarins in die Kapsel, wurde die Luke des Wostok-Raumschiffs geschlossen. Nachdem eine Anzeige jedoch darauf hinwies, dass die Luke nicht korrekt verriegelt war, mussten drei Techniker alle 30 Sicherungsschrauben wieder entfernen und die Luke ein zweites Mal schließen. Die Panne führte zu leichten Verzögerungen, sodass die Umgebung der Startrampe erst 30 Minuten vor dem Abheben geräumt werden konnte. Eine Viertelstunde später wurden die Wartungsplattformen, die die Trägerrakete umgaben, zurückgefahren. Der Countdown wurde eine Minute vor dem Start planmäßig für fünf Minuten angehalten. Juri Gagarin berichtete, dass er bereit für den Start sei und das Arbeiten der Ventile spüren könne.

Wenige Sekunden vor dem Start begann die Zündungssequenz der fünf Triebwerke der ersten und zweiten Raketenstufe. Nachdem die Rakete die volle Schubkraft von knapp 400 Tonnen erreicht hatte, lösten sich die vier Haltearme. Um 09:06:59,7 MST (06:06:59,7 UTC) am 12. April 1961 startete Wostok mit Juri Gagarin an Bord.

Während des Aufstiegs der Wostok-Trägerrakete erhöhte sich wegen der zunehmenden Beschleunigung die g-Kraft, wodurch Juri Gagarin in seine Liege gedrückt wurde. 119 Sekunden nach Flugbeginn wurde die aus vier Boostern bestehende erste Stufe abgetrennt. Eine knappe Minute später folgte die Absprengung der Nutzlastverkleidung, die das Raumschiff beim Start umgeben hatte. Bei einer Belastung von 5 g bemerkte Juri Gagarin leichte Schwierigkeiten beim Sprechen. Nach fünf Minuten Flugzeit schalteten die Triebwerke der zweiten Stufe ab, wodurch die g-Kraft rapide abnahm und Juri Gagarin in den Gurt seines Sitzes gedrückt wurde. Nach dem Ablösen der zweiten Stufe beschleunigte das Triebwerk der dritten Stufe die Wostok auf Orbitalgeschwindigkeit. Juri Gagarins Puls erreichte während der Startphase einen Höchststand von 150 Schlägen pro Minute. Um 09:21 MST (06:21 UTC) – 676 Sekunden nach dem Abheben – erreichte das Raumschiff die Erdumlaufbahn, nachdem kurz zuvor die dritte Raketenstufe abgetrennt worden war. Wegen einer mangelhaften Leistung der Trägerrakete erreichte das Wostok-Raumschiff einen höher als vorgesehenen Orbit, dessen Apogäum (größter Erdabstand) 70 Kilometer über dem geplanten Wert lag.

Sofort nach dem Eintreten in die Erdumlaufbahn stellte Juri Gagarin eine Funkverbindung mit dem Kontrollzentrum her und bestätigte, dass er sich sehr gut fühle. Er schilderte außerdem die Eindrücke, die er beim Blick aus einem der Bullaugen erhielt.

Während des gesamten Flugverlaufs beschrieb Juri Gagarin in regelmäßigen Abständen seine gesundheitliche Verfassung und den Zustand der Systeme des Raumschiffs. Seine Berichte wurden durch eine Funksendeanlage auf den Kurzwellenfrequenzen 9,019 MHz und 20,006 MHz sowie auf der Ultrakurzwellenfrequenz 143,625 MHz zu den Bodenstationen in der Sowjetunion weitergeleitet. Daneben konnten Juri Gagarins Kommentare durch ein Tonbandgerät aufgezeichnet werden, falls sich das Raumschiff nicht in Reichweite der Erdfunkstationen befand. In der Kapsel waren zudem zwei Fernseh-Kameras montiert, die eine Profil- sowie eine Frontal-Ansicht Juri Gagarins lieferten.

Juri Gagarins Arbeitspensum während des Flugs war äußerst niedrig. Die Durchführung von wissenschaftlichen Untersuchungen war für Wostok nicht vorgesehen. Die Zeit im Orbit nutzte Juri Gagarin im Wesentlichen für Beobachtungen der Erdoberfläche und die Überwachung der Geräte an Bord der Kapsel. Die manuelle Steuerung des Raumschiffs war vor dem Flug blockiert worden, da Mediziner Bedenken wegen möglicher negativer Auswirkungen des Zustands der Schwerelosigkeit auf den Kosmonauten geäußert hatten. Juri Gagarin hätte einen sechsstelligen Code eingeben müssen, um das manuelle Kontrollsystem zu entsichern. Die ersten drei Ziffern waren Juri Gagarin bekannt, während die drei verbliebenen Stellen des Codes in einem speziellen Umschlag aufbewahrt wurden, den Juri Gagarin nur im Fall eines Verlusts der Funkverbindung öffnen durfte.

Um 09:49 MST (06:49 UTC) trat Wostok über dem Pazifischen Ozean in den Erdschatten ein. Den Übergang zwischen Tag- und Nachtseite beschrieb Juri Gagarin später als sehr abrupt. Gegen 09:51 MST (06:51 UTC) aktivierten sich die Sonnensensoren der Lagesteuerung, die das Raumschiff später für die Bremszündung ausrichteten. Außerdem wurde um 09:57 MST (06:57 UTC) der Befehl zum Starten des Landesystems durch eine Bodenstation in Chabarowsk an das Raumschiff gesendet. Unterdessen meldete Juri Gagarin fälschlicherweise, dass er sich über den Vereinigten Staaten befinde, obwohl er zu diesem Zeitpunkt den Südpazifik in Richtung Kap Hoorn überflog.

Knapp eine Stunde nach dem Start begann Juri Gagarin mit den Vorbereitungen für den Wiedereintritt in die Erdatmosphäre, indem er unter anderem die Rollladen von zwei der drei Bullaugen herunterfuhr und sein Helmvisier schloss. Das Wostok-Raumschiff, das um 10:09 MST (07:09 UTC) den Erdschatten verlassen hatte, befand sich derweil in einer leichten Drehung, um die Sonneneinstrahlung gleichmäßig über die Oberfläche zu verteilen. Später wurde das Raumfahrzeug mit Hilfe der Sonnensensoren in die richtige Position für die Bremszündung gebracht, bei der das Triebwerk entgegen der Flugrichtung ausgerichtet ist. Um 10:25 Uhr MST (07:25 UTC) zündete die Bremsrakete TDU-1 für genau 40 Sekunden, um Geschwindigkeit abzubauen und damit den Wiedereintritt einzuleiten. Bei der Abschaltung des Bremstriebwerks über Afrika nahm Juri Gagarin eine leichte Zunahme der g-Kräfte wahr.

Kurz nach der erfolgreichen Bremszündung kam es zum einzigen schwerwiegenden Zwischenfall der Mission, da der größere Geräteteil des Raumschiffs sich nicht wie vorgesehen von der bemannten Landekapsel trennte. Juri Gagarin war sich des Problems durch die Anzeigenleuchten in der Kabine bewusst und schätzte, die zusätzliche Masse des Geräteteils würde die Landestelle der Kapsel in den Fernen Osten der Sowjetunion verschieben. Währenddessen begann das Raumfahrzeug sich mit hoher Geschwindigkeit um die eigene Achse zu drehen, da es mit dem Geräteteil nicht seinen natürlichen Schwerpunkt finden konnte.

Auch zwei Minuten nach Ende der Bremszündung war die Abtrennung des Geräteteils noch nicht erfolgt. Obwohl die eigentliche Trennvorrichtung die beiden Module offenbar pünktlich voneinander gelöst hatte, blieben die beiden Komponenten durch einige Kabel lose miteinander verbunden, sodass das Raumschiff mit der schweren Landekapsel voraus in die Erdatmosphäre eintrat. Juri Gagarin blieb während des Vorfalls ausgesprochen ruhig und übermittelte der Bodenstation, dass alles an Bord normal abliefe. Die Abtrennung des Geräteteils erfolgte schließlich 10 Minuten später als vorgesehen um 10:35 Uhr MST (07:35 UTC), nachdem die Kabel zwischen den beiden Modulen wegen der atmosphärischen Reibung durchgebrannt waren. Wenig später nahm die Rotation des Raumschiffs ab.

In einer Höhe von 7.000 Metern öffnete sich der Hauptfallschirm des Raumschiffs. Wenig später wurde die Luke hinter Juri Gagarins Kopf mit der Zündung einer Sprengladung abgetrennt und Juri Gagarin zwei Sekunden darauf per Schleudersitz aus der Landekapsel katapultiert. Die Landeregion lag nur wenig entfernt vom vorausberechneten Gebiet in der Nähe der Stadt Saratow, wo die Trainingssprünge der Kosmonauten stattgefunden hatten. Juri Gagarin trennte sich von seinem Sitz, woraufhin sich sein Fallschirm öffnete. Kurz vor dem Aufsetzen löste sich auch der Reservefallschirm, jedoch ohne sich zu entfalten oder sich in den Leinen des Hauptfallschirms zu verfangen.