Der Start erfolgte von Cape Canaveral (KSC) und das Space Shuttle landete auf der Edwards AFB, Runway 22. Der ursprünglich für den 19. Januar 2001 festgesetzte Start musste wegen technischer Probleme abgesagt werden. Diese erforderten eine Rückführung des Space Shuttles zum Montagegebäude VAB, um die Kabel für die Trennung der Feststoffraketen zu kontrollieren.

Ursprünglich war Mark Lee als Besatzungsmitglied vorgesehen. Im September 1999 wurde er jedoch aus der Mannschaft genommen und durch Robert Curbeam ersetzt. Die NASA gab keine Gründe hierfür an.

Die Mannschaft der Mission ISS-06-5A Lab "Destiny" lieferte das amerikanische Labormodul Destiny als Erweiterung der im Bau befindlichen Internationalen Raumstation (ISS). Insgesamt war die Raumfähre Atlantis sechs Tage mit der Station verbunden. In dieser Zeit führte die Crew drei Ausstiege durch, um Destiny zu installieren und in Betrieb zu nehmen.

Destiny (englisch für Schicksal) ist das vierte Modul der Internationalen Raumstation und das zweite aus den USA. Es hat eine zylindrische Form, ist 8,5 m lang, hat einen Durchmesser von 4,3 m und eine Leermasse von 14,5 t. Vollständig ausgerüstet liegt seine Masse bei 24,0 t. Am Heck ist Destiny dauerhaft mit dem Kopplungsmodul Unity, am Bug mit dem Verbindungsknoten Harmony verbunden.
Die Hülle des Labormoduls besteht aus Aluminium und ist zusätzlich mit einem Mikrometeoritenschutz umgeben. Dieser besteht aus einem Material, das dem schusssicherer Westen ähnelt. Destiny verfügt über ein großes Fenster, das sich mit einer Art Fensterladen verschließen lässt. Über dieses Fenster soll vor allem erdbezogene Forschung erfolgen.
Insgesamt stehen 24 Standard-Racks zur Verfügung: 13 davon können für Experimente und wissenschaftliche Ausrüstung, während die übrigen 11 zur Steuerung oder als Lagerraum genutzt werden. Beim Start waren vier Racks montiert. Sie dienen in erster Linie der Steuerung der wichtigsten Systeme und der Lebenserhaltung. Enthalten sind Anlagen zur Luftventilation, zwei Kühlsysteme auf Wasserbasis (4 °C- und 17 °C-System), zwei sogenannte Avionics-Racks mit Steuerungssystemen für die interne Kommunikation, für Lageregelung, Lebenserhaltung, Umweltdaten, Kopplungsmechanismen, Druckausgleich, Befehls- und Datenverarbeitung sowie das Energie- und das Alarmsystem (Feuerdetektion und Luftdruckkontrolle). Zusätzlich installiert wurde ein fünftes Rack mit einem Luftaufbereitungssystem.

Nach dem Erreichen der Erdumlaufbahn öffnete die Besatzung die Frachtraumtüren der Atlantis, testete den Greifarm RMS in seinen verschiedensten Funktionen, klappte die für das Rendezvous erforderliche Ku-Band-Antenne aus und begann mit der Angleichung der Flugbahn zur Internationalen Raumstation. Ebenso montierten sie im "Orbiter Docking System" die "Centerline Camera", die Kommandant Kenneth Cockrell das spätere Docking erleichtern soll.

Den Gesetzen der Bahnmechanik folgend holte die Atlantis von ihrer ersten Umlaufbahn und weiteren Triebwerkszündungen in den folgenden beiden Tagen immer mehr zur Internationalen Raumstation auf. Am dritten Flugtag, dem 09. Februar 2001, hatte die Atlantis einen Punkt 15 Kilometer hinter der Raumstation erreicht. Für den Anflug im Rahmen des sogenannten "R-Bar Approach" musste das Space Shuttle nochmals seine Bahn senken, sodass sich die Atlantis schließlich etwa 180 Meter unterhalb der Internationalen Raumstation befand. Ab dieser Distanz übernahm Kenneth Cockrell die manuelle Steuerung und flog entlang des sogenannten "R-Bar" (gedachte Verbindungslinie zwischen der Raumstation und dem Erdmittelpunkt) hinauf zur ISS. Nach den üblichen Haltepunkten bei 52 Meter und 9 Meter vor der ISS reduzierte er die Annäherungsgeschwindigkeit auf zuletzt nur noch 3 Zentimeter pro Sekunde. Wie die Kommandanten bei allen Kopplungsmissionen steuerte er den Raumgleiter von der hinteren Konsole im Flugdeck aus, weil er von dort freie Sicht auf die Raumstation hatte. Ohne Probleme konnte er sein Raumschiff an die ISS ankoppeln. Die Atlantis dockte als erstes Raumschiff an den Kopplungsadapter PMA-3, welcher sich zum damaligen Zeitpunkt am Nadir-Port von Unity befand, an.

Nach einer kurzen Begrüßungszeremonie mit der ersten Expedition der ISS, bei der auch Wasser, ein Computer, Kabel, frisches Obst, Spielfilme auf DVD und weitere persönliche Familiengeschenke in die Station gelangten, wurden die Luken für die bevorstehenden Außenbordarbeiten wieder geschlossen.

Am Morgen des 11. Februar 2001 demontierte Marsha Ivins mit Hilfe des Greifarms der Atlantis den Kopplungsadapter PMA-2 von Unity und transportierte ihn an eine vorgesehene Zwischenposition an der Gitterstruktur der Station. Erst danach erfolgte die erste EVA durch Thomas Jones und Robert Curbeam am 10. Februar 2001 (7h 33m). Nach dem Verlassen der Schleuse begab sich Thomas Jones zur Gitterstruktur und kontrollierte die korrekte Position des Adapters. Danach fungierte er als Lotse für den Transport des Labormoduls Destiny. Robert Curbeam hatte währenddessen die Halterungen von Destiny sowie die Stromkabel und Kühlleitungen gelöst sowie Schutzverkleidungen von den Kopplungsmechanismen entfernt. Mit dem Greifarm wurde das Modul anschließend aus der Ladebucht gehoben, um 180° gedreht und in die korrekte Position am Modul Unity gebracht. Automatische Kopplungsbolzen sicherten anschließend die Verbindung. Dann verbanden Thomas Jones und Robert Curbeam eine Reihe von Strom- und Datenkabeln sowie Kühlmittelleitungen zwischen Unity und Destiny. Aus einer der Leitungen trat dabei eine geringe Menge Ammoniak in kristalliner Form aus. Um eine Kontamination des Shuttle zu vermeiden, hielt sich Robert Curbeam eine halbe Stunde lang im direkten Sonnenlicht auf, um die Kristalle verdampfen zu lassen. Thomas Jones bürstete ihn und die Ausrüstung zusätzlich ab. Nach dem Wiedereinstieg und einem Druckausgleich zwischen Schleuse und Shuttle-Kabine trugen die Astronauten etwa 20 Minuten lang Atemmasken. Danach konnte eine Kontamination ausgeschlossen werden.

Anschließend betraten beide Crews das neue Modul und arbeiteten am Anschluss und der Aktivierung wichtiger Anlagen. Dazu gehörten Luftventilation, zwei Kühlsysteme auf Wasserbasis (4°C- und 17°C-System), zwei sogenannte Avionics-Racks mit Steuerungssystemen für die interne Kommunikation, für Lageregelung, Lebenserhaltung, Umweltdaten, Befehls- und Datenverarbeitung sowie das Energiesystem. Zusätzlich installiert wurde ein Rack mit einem Luftaufbereitungssystem. Es absorbiert normalerweise Kohlendioxid aus der Stationsluft und unterstützt damit das Vosduch-System, das im Modul Swesda untergebracht ist, konnte aber wegen eines Defekts nicht in Betrieb genommen werden. Aktiviert wurden aber die Bordcomputer sowie das Feuermelde- und Alarmsystem.

Die zweite EVA durch Thomas Jones und Robert Curbeam erfolgte am 12. Februar 2001 (6h 50m). Dabei wurde zunächst der Kopplungsadapter PMA-2 von seiner zeitweiligen Position am Gitterelement Z1 zur Front des Labormoduls Destiny transportiert und dort angedockt. Diese Aufgabe übernahm Marsha Ivins, die den Greifarm des Shuttle bediente. Thomas Jones und Robert Curbeam überwachten das Lösen bzw. später das Einrasten der automatischen Verriegelung. Danach befestigten sie Abdeckungen an den Haltebolzen im Laderaum der Atlantis, montierten einen Entlüftungskanal, mehrere Halterungen und Spanndrähte für spätere Außenbordarbeiten und einen Sockel für den kanadischen Greifarm der Station an Destiny. Dieser Greifarm wurde bei einer späteren Shuttle-Mission zunächst an Destiny angebracht und erst später auf einen Führungsschlitten verlegt. Auf diesem kann er dann auf der Gitterstruktur entlanggleiten und an verschiedenen Orten genutzt werden. Da Thomas Jones und Robert Curbeam die geplanten Arbeiten schneller ausführten als geplant, konnten sie anschließend noch Strom- und Datenleitungen zwischen dem Labormodul und dem Kopplungsadapter verbinden, die Verkleidung am Fenster des Labormoduls entfernen und eine Fensterklappe montieren, deren Schließmechanismus von innen bedient werden kann. Während des Wiedereinstiegs der beiden Astronauten wurden die Gyroskope auf Touren gebracht. Sie wurden an den folgenden Tagen umfassend getestet und übernehmen seither die Lageregelung für die gesamte Station. Die Steuerung erfolgt durch die Bordcomputer des Labormoduls.

Die dritte und letzte EVA unternahmen Thomas Jones und Robert Curbeam am 14. Februar 2001 (5h 25m). Die Astronauten montierten eine Reserve-Antenne (S-Band), überprüften sorgfältig die physischen Verbindungen zwischen Destiny und dem Kopplungsadapter PMA-2 und lösten die Sicherung des dritten Radiators an der Gitterstruktur. Er wird für die Abstrahlung überschüssiger Wärme, die im neuen Stationsmodul entsteht, benötigt. Den Abschluss der Arbeiten bildete die Dokumentation der Außenhaut der neuen Bauteile durch Fotografien und die Erprobung eines Rettungsverfahrens für bewusstlose Raumfahrer während eines Ausstiegs. Es war der 100. amerikanische Weltraumspaziergang.

Am letzten gemeinsamen Arbeitstag mit der ISS-Mannschaft wurden weitere Materialien in die Station transportiert. Zu den insgesamt 1,5 Tonnen Versorgungsgütern gehörten neben Wasser und Nahrung vor allem Ersatzteile, Bekleidung, Werkzeug, Computerzubehör, ein Ersatzcomputer, eine Reserveanlage zur Kohlendioxidabsorption und ein Raumanzug für Außenbordeinsätze. In der Gegenrichtung wurden 420 Kilogramm Abfall und Verpackungsmaterial entsorgt. Außerdem fanden eine Videokonferenz mit Schülern in Maryland sowie eine Pressekonferenz mit Journalisten und Wissenschaftlern in den Kontrollzentren in Houston und Moskau statt. An den zurückliegenden Tagen war die Bahn des Komplexes während vier Antriebsperioden um knapp 30 Kilometer angehoben worden.

Während der Mission wurden auch einige kleinere wissenschaftliche Untersuchungen angestellt. Zum einen wurde ein mit einer Vielzahl von eingefrorenen Proteinproben gefülltes Gefäß in die Station transportiert. Das Gefäß ist von flüssigem Stickstoff umgeben. Dieser verdampft allmählich, wodurch die Temperatur im Gefäß steigt und die Proben auftauen. Nach etwa 11 Tagen beginnt dann die Kristallisation der Proteine. Die Proben wurden zur genaueren Untersuchung bei der Mission STS-102 im März 2001 zurück zur Erde gebracht. Das Student Crystal Experiment wurde von über 400 Schülern 89 amerikanischer Schulen geplant. Mit diesem und weiteren Experimenten (SEEDS, EarthKAM) will die NASA Interesse und Begeisterung an der bemannten Raumfahrt fördern.

In Antriebsphasen wird der gesamte Komplex in Vibrationen versetzt. Mit speziellen Geräten an Bord der Atlantis wurden die Frequenzen bestimmt, bei denen die Station besonders stark mitschwingt. Wenn weitere Teile an die Station angebaut werden, verändern sich auch diese sogenannten Eigenfrequenzen. Deshalb wird dieses Experiment bei zukünftigen Missionen wiederholt.

Die heißen Abgase der Shuttle-Triebwerke haben große Auswirkungen auf die umgebende Ionosphäre. Sie verursachen chemische Veränderungen, in deren Folge ein etwa 50 Kilometer messendes Loch in der Ionosphäre entsteht. Mehrere dieser Löcher wurden von der Erde aus mit Radar und Laser analysiert. Weitere Routineuntersuchungen betrafen die Wiederanpassung an die Schwerkraft nach dem Flug, Veränderungen im Immunsystem der Astronauten und die Aufzeichnung von GPS-Daten während des gesamten Fluges.

Am 16. Februar 2001 koppelte die Atlantis-Besatzung mittels Federkraft wieder von der ISS ab. Dadurch werden Beschädigungen oder Verunreinigungen der Station vermieden. Erst danach wurden die Steuerungstriebwerke aktiviert und die Raumfähre entfernte sich von ihr bis zu einer Distanz von etwa 150 Meter. Von dort aus umflog Mark Polansky die Orbitalstation eineinhalb Mal, ehe die Triebwerke der Atlantis erneut gezündet wurden und der Raumgleiter seine Distanz vergrößerte.

Wegen schlechten Wetters am Kennedy Space Center musste die Landung um zwei Tage verschoben und der Landeort zur Edwards AFB verlegt werden.