Start von Cape Canaveral (KSC) sowie Landung auf Cape Canaveral (KSC), Runway 33.

Am 16. Januar 1998 gab die NASA bekannt, das John Glenn, der 36 Jahre zuvor mit Mercury 6 als erster Amerikaner in eine Erdumlaufbahn gestartet war, an Bord eines Space Shuttle erneut ins All fliegen sollte. John Glenn, inzwischen langjähriger amerikanischer Senator, hatte schon vor der Challenger-Katastrophe sein Interesse an einem zweiten Raumflug bekundet. Damals hatte die NASA Programme aufgelegt, in deren Rahmen Lehrer, Journalisten und Politiker zu einem Raumflug eingeladen werden sollten. Da seither 10 Jahre vergangen waren, sah John Glenn nur noch die Chance, gerade wegen seines fortgeschrittenen Alters mitfliegen zu können. Während der Spacelab-Missionen hatte sich herausgestellt, dass viele Symptome des menschlichen Alterungsprozesses mit den Auswirkungen der Schwerelosigkeit übereinstimmen. John Glenn konnte sowohl den damaligen amerikanischen Präsidenten Bill Clinton als auch den damaligen NASA-Chef Dan Goldin davon überzeugen, diesen Zusammenhang an seinem eigenen Körper zu untersuchen. Ganz nebenbei war sein zweiter Raumflug natürlich enorm öffentlichkeitswirksam, was für die NASA beim Kampf um Steuergelder von erheblicher Bedeutung ist. Bis heute ist John Glenn der älteste Mensch, der jemals ins All flog.

Zu den wesentlichen Missionszielen zählten das Aussetzen und Wiedereinfangen des Freiflugsatelliten SPARTAN 201-5, Tests mit der HOST-Plattform ("HST Orbital Systems Test"), das Aussetzen des Experimentalsatelliten PANSAT ("Petite Amateur Naval SATellite"), eine Reihe von wissenschaftlichen Experimenten im Spacehab-Single Module natürlich die an und von John Glenn geplanten Versuche.

Während der Vorbereitungen auf der Startrampe war wegen des herannahenden Hurrikans George ein Rücktransport der Discovery in die sturmsichere Montagehalle VAB erwogen worden. Vorarbeiten dazu waren bereits im Gange, als der Sturm doch noch an Cape Canaveral vorbeizog. Ansonsten verlief der Countdown weitestgehend problemlos.

Für den Aufstieg in die Erdumlaufbahn hatte die NASA wie in letzter Zeit immer ein gegenüber frühen Shuttle-Missionen verändertes Flugprofil gewählt. Damals hing der Orbiter in der Startphase unten am externen Außentank, sodass die Astronauten an Bord kopfüber ihre Reise ins All antreten. Damit konnte der Funkkontakt mit allen zur Verfügung stehenden Bodenstationen während des gesamten Aufstiegs erhalten bleiben. Zur Einsparung einer Bodenstation führte die Discovery nun nach etwa sechs Minuten Flugzeit ein Rollmanöver um 180 Grad durch. Den Rest des Weges in den Orbit saßen die Astronauten dann aufrecht auf dem externen Tank.
Nach der Zündung der Feststoffbooster, aber noch vor dem Abheben der Discovery hatte sich vermutlich durch starke Vibrationen die Abdeckklappe des Bremsschirmbehälters gelöst. Da sich die Klappe über dem mittleren Haupttriebwerk befand, muss sie genau auf die Schubdüse gefallen sein. In Anbetracht des geringen Gewichtes und der geringen Fallhöhe konnten aber glücklicherweise keine Beschädigungen festgestellt werden.

Nach dem Erreichen der Erdumlaufbahn und dem Öffnen der Frachtraumtüren aktivierte die Besatzung das Spacehab und seine Experimente. Vor der ersten Nachtruhe schluckte John Glenn ein kleines Gerät, mit dem seine Körpertemperatur bis auf ein zwanzigstel Grad genau gemessen werden konnte.

Am zweiten Flugtag testeten Scott Parazynski und Stephen Robinson den Greifarm des Shuttle in den verschiedensten Betriebsarten, da dieser für das Aussetzen von SPARTAN zwingend gebraucht wurde. Zunächst wurde aber PANSAT ("Petite Amateur Naval SATellite") per Federkraft in den freien Weltraum katapultiert. Der kleine Satellit war in einem GAS-Kanister untergebracht und sollte als Experimentierwerkzeug auf dem Gebiet des Breitband-Funkverkehrs dienen.

Am 31. Oktober 1998, dem dritten Tag im All, begann John Glenn mit seinen medizinischen Experimenten. In deren Verlauf hatte er zehn Blut- und 16 Urinproben abzugeben. Als Vergleichsperson diente Pedro Duque, der damals mit 35 Jahren weniger als halb so alt wie John Glenn war.
Kanadische Wissenschaftler nutzten die Frachtraumkameras, um das von ihnen entwickelte "Space Vision System" einem weiteren Test zu unterziehen. Beim Aufbau der Internationalen Raumstation soll es eine bedeutende Rolle spielen.

Höhepunkt des vierten Flugtages sollte das Aussetzen der Freiflugplattform SPARTAN 201-5 sein. Während im Mitteldeck die medizinischen und materialwissenschaftlichen Experimente weiterliefen, bereitete sich Stephen Robinson auf den Aussetzvorgang vor. Im Verlauf des Fluges STS-87 wäre SPARTAN 201-4 fast im Weltraum verloren gegangen, weil sich bei der Aussetzsequenz ein Fehler eingeschlichen hatte. Insofern war SPARTAN 201-5 ein Wiederholungsflug.
Die Trägerplattform hat etwa die Ausmaße 1,30 m x 1,10 m x 1,20 m und ihr Gewicht liegt je nach Mission bei 1,0 bis 1,3 Tonnen. Ähnlich wie bei STS-64 durchgeführt und bei STS-87 geplant, wollte man Experimente zur Solarphysik in Koordination mit einen analogen Satelliten - SOHO - durchführen. Wie bei allen vorhergehenden Einsätzen war SPARTAN wieder mit den beiden Sonnenforschungsinstrumenten "White Light Coronagraph" (WLC) und "Ultraviolet Coronal Spectrometer" (UVCS) bestückt. Ein Teil der Sonnenbeobachtungen wurden mit den Ergebnissen des Satelliten SOHO koordiniert. Die SPARTAN-Instrumente liefen so gut, dass mehr Daten geliefert wurden, als auf die Magnetbandspeicher passten. Rund 1.100 Aufnahmen der Sonnenkorona wurden entweder zur Erde gefunkt oder aufgezeichnet. Dazu kamen 300 gewonnene UV-Spektren.
Nach dem Funktionscheck aller Systeme ergriff Stephen Robinson mit dem RMS den Greifstutzen an SPARTAN und die Haltevorrichtungen an der Trägerstruktur in der Ladebucht wurden geöffnet. Stephen Robinson hob SPARTAN aus dem Frachtraum hinaus und brachte den Satelliten in Aussetzposition. Nach einer letzten Überprüfung der Systeme zog er den Greifarm vorsichtig zurück und der Freiflug begann. Im Gegensatz zu STS-87 aktivierten sich die Systeme von SPARTAN und brachten die Freiflugplattform in die vorgesehene Fluglage. Curtis Brown feuerte die Manövertriebwerke der Discovery, sodass die beiden Raumflugkörper langsam auseinanderdrifteten. Zunächst wurde der Abstand bei 10 bis 16 Kilometer belassen, weil die NASA ein TEXAS genanntes Kommunikationssystem testen wollte. Dabei sollte der Orbiter als eine Art Relaisstation zwischen SPARTAN und der Bodenstation dienen.

In den folgenden Tagen gingen die wissenschaftlichen Versuche an Bord der Discovery weiter, wobei John Glenn weiterhin im Blickpunkt der Öffentlichkeit stand. So trug er zeitweise ein Netz mit Elektroden über dem Kopf. Damit wurden während des Schlafes Gehirnströme, Augenbewegungen, Muskelspannung, allgemeine Körperbewegungen und Schweißentwicklung gemessen. Vergleichsperson bei diesem Versuch war Chiaki Mukai.

Im Mittelpunkt des siebten Flugtages stand die Bergung der Freiflugplattform SPARTAN 201-5. Durch mehrere Kurskorrekturen hatten sich die Bahnen der beiden Raumflugkörper allmählich angenähert. Schließlich befand sich die Discovery auf gleicher Bahnhöhe, aber 15 Kilometer hinter SPARTAN. Von hier aus begannen die Piloten ein Rendezvous nach dem Verfahren "R-Bar Approach". Nach einer kurzen Triebwerkszündung senkte der Orbiter seine Flugbahn und beschrieb eine viertelkreisförmige Bahn bis er direkt unterhalb von SPARTAN angekommen war. Für die Endphase des Rendezvous flogen die Piloten entlang einer gedachten Geraden Erdmittelpunkt-SPARTAN. In einem Abstand von 10 Metern konnte Stephen Robinson SPARTAN 201-5 mit dem Greifarm der Discovery festhalten und sicher auf seiner Haltestruktur im Frachtraum verstauen. Der Freiflug hatte knapp 50 Stunden gedauert.

Das Spacehab ist ein druckbelüftetes Modul mit einer Gesamtmasse von 5.387 Kilogramm. Bei den Shuttle-Mir-Flügen war es in erster Linie für den Transport von Logistikmaterial genutzt worden. Bei STS-95 diente es der Durchführung zahlreicher Experimente. Dabei waren 45 Prozent der Nutzlastkapazität an private Firmen und Institute vermietet worden. Die Palette der Experimente reichte von der Erzeugung hochreiner Kristalle über biomedizinische Versuche bis zu Vestibular-Experimenten.

Die Discovery führte auch die HOST-Plattform ("HST Orbital Systems Test") mit. Dabei handelte es sich um jene Haltestruktur, die bei STS-48 den Satelliten UARS im Frachtraum beherbergt hatte. Bei STS-95 diente die Haltestruktur für Tests im Hinblick auf den nächsten Wartungsflug für das HST (STS-103). Konkret handelte es sich um ein neuartiges Kühlsystem für das Infrarotinstrument NICMOS. Die NASA wollte vorab die Funktionstüchtigkeit unter den Bedingungen der Schwerelosigkeit austesten. Außerdem sollte eine neue Software getestet werden, die Schäden durch Weltraumstrahlung in Speichermedien erkennt und überbrückt. Der "Solid State Recorder", der bereits auf dem HST Verwendung findet und dort Anomalien aufwies, sollte bei STS-95 Strahlungsbedingungen ausgesetzt werden. Die Techniker wollten so dem Grund für die Fehlfunktionen auf die Spur kommen. Letztlich wurden noch neuartige Glasfaserkabel getestet.

Ebenfalls in der Ladebucht befand sich der wissenschaftliche Komplex IEH-3 ("International Extreme Ultraviolet Hitchhiker"), der aus sechs Einzelexperimenten bestand. So wurden mit dem UVSTAR-Teleskop Untersuchungen im extremen Ultraviolettbereich vorgenommen, die dem Studium des Plasmas von Jupiter, dessen Mond Io und heißen Sternen dienten. Beim Experiment "Cryogenic Thermal Storage Unit" (CRYOTSU) ging es hauptsächlich um die Kühlung von Raumflugkörpern. Insbesondere wurden Versuche zur Kühlung elektrisch betriebener Geräte betrieben.
Im "Space Experiment Module" (SEM)-4 waren acht kleinere Schülerexperimente untergebracht. In einem Experiment wurden die Eigenschaften von Gegenständen des täglichen Lebens wie Kaugummi, Popcorn, Brot, Kreide, Radiergummis und Bleistiften vor und nach einem Raumflug untersucht.

Für die Landung waren Curtis Brown und Steven Lindsey angewiesen worden, den Bremsfallschirm auf keinen Fall auszustoßen. Niemand kannte den Zustand des Schirmes und der Gurte nach dem Raumflug mit offener Klappe. Sorgen bereitete der NASA die Möglichkeit, dass sich der Schirm beim Landeanflug von selbst aus seinem Behälter lösen könnte. Im schlimmsten Fall würde bei Geschwindigkeiten von unterhalb 500 km/h durch die plötzliche Bremswirkung eine Bruchlandung vor Erreichen der Landebahn die Folge sein. Da sich dies durch ein plötzliches Anheben der Bugnase des Orbiters bemerkbar machen würde, sollte Steven Lindsey in diesem Fall sofort drei Schalter im Cockpit umlegen, mit denen die Schirmleinen vom Orbiter abgetrennt würden. Alle Überlegungen waren unnötig gewesen, weil der Bremsschirm in seiner Kammer blieb. Bei späteren Untersuchungen erwiesen sich der Bremsschirm und die Haltegurte als nahezu unbeschädigt.