Der Start erfolgte von Cape Canaveral (KSC) und auf Cape Canaveral (KSC), Runway 15, landete STS-135 auch wieder.

Ursprünglich war zwischen dem 18. und 26. November 2007 eine Mission angesetzt, die ebenfalls als STS-135 bezeichnet wurde. Es sollte die ISS-Aufbaumission ISS-17A geflogen werden, mit der ein MPLM und ein LMC zur Station gebracht worden wäre. Nach der Columbia-Katastrophe wurde dieser Flug abgesetzt. ISS-17A wurde dann leicht abgewandelt mit der Mission STS-128 ausgeführt.

31 Sekunden vor dem geplanten Start gab es eine Unterbrechung des Countdowns durch den Computer, da unklar war, ob ein Ausleger des Startturms vollständig zurückgezogen war. Nach drei Minuten wurde der Countdown fortgesetzt und die Atlantis startete erfolgreich.

Zu den wesentlichen Aufgaben des Fluges (ISS ULF-7 MPLM Raffaello) gehörten: Anlieferung des Raffaello Multi Purpose Logistics Module (MPLM), das mit Ausrüstungsgegenständen und Ersatzteilen zum Betrieb der Raumstation nach den Shuttle-Missionen gefüllt war; Transport des Robotic Refueling Mission (RRM), einem speziell entwickelten Experiment zum Nachbetanken von Satelliten im Orbit, selbst wenn diese dafür nicht konstruiert waren; Rücktransport einer ausgefallenen Ammoniak-Pumpe, damit die Ingenieure die Ursachen für den Ausfall ergründen können.
Dies war die letzte Mission der Atlantis und des gesamten Space-Shuttle-Programms.
Die Mannschaft von nur vier Personen war die kleinste seit April 1983 (STS-6).

Das Multi-Purpose Logistics Module (MPLM) Raffaello, (Deutsch Mehrzwecklogistikmodul), wurde verwendet, um bei Space-Shuttle-Missionen Frachten zu und von der Internationalen Raumstation (ISS) in einem unter Luftdruck stehenden Raum zu transportieren.
Das Modul wurde während des Transportes mit dem Shuttle in dessen Ladebucht befestigt. Nach dem Andocken an die ISS wurde das MPLM mit Hilfe des Roboterarmes Canadarm2 aus der Ladebucht gehoben und am Harmony-Modul angekoppelt. Anschließend wurde die Luke des Moduls geöffnet und die Astronauten erhielten Zugang zum MPLM, um es zu entladen sowie mit den zur Erde zu bringenden Frachten zu beladen. Bevor das Shuttle von der Station ablegte, wurde das Modul wieder in der Ladebucht befestigt und kehrte anschließend zusammen mit der Raumfähre zur Erde zurück.
Der wesentliche Vorteil dieses Verfahrens lag darin, dass Transportgüter, insbesondere die sogenannten International Standard Payload Racks, direkt vom MPLM in den amerikanischen Teil der Station verladen werden konnten. Kopplungsadapter vom APAS-Typ russischer Bauart, die auch zum Andocken des Space Shuttles benutzt werden, haben einen wesentlich geringeren Durchmesser und lassen kein Verladen sperriger Gegenstände zu. Weiterhin ermöglichte der Einsatz des MPLM, nicht mehr benötigte Ausrüstung und beendete Experimente zurück zur Erde zu transportieren. Andere Transportschiffe wie die unbemannten Progress- und ATV-Frachter verglühen beim Wiedereintritt und transportieren daher ausschließlich Müll von der Station ab.

Nach dem Erreichen der Erdumlaufbahn öffnete die Besatzung die Frachtraumtüren der Atlantis, testete den Greifarm RMS in seinen verschiedensten Funktionen, klappte die für das Rendezvous erforderliche Ku-Band-Antenne aus und begann mit der Angleichung der Flugbahn zur Internationalen Raumstation. Ebenso montierten sie im "Orbiter Docking System" die "Centerline Camera", die Kommandant Christopher Ferguson das spätere Docking erleichtern soll.
Außerdem wurde der Hitzeschild der Atlantis auf eventuelle Schäden untersucht, die beim Start durch sich vom Außentank ablösende Isolierschaumstücke entstanden sein könnten. Dabei wurde der OBSS-Inspektionsarm eingesetzt, der nach dem Columbia-Unglück entwickelt wurde. Der OBSS ist ein 15 Meter langer "Aufsatz", der mit dem Roboterarm des Shuttles verbunden wird. Der Kopf des OBSS ist mit Laser-Sensoren und hochauflösenden Kameras ausgestattet und tastet halbautomatisch die Hitzeschutzkacheln des Orbiters ab.

Den Gesetzen der Bahnmechanik folgend holte die Atlantis von ihrer ersten Umlaufbahn und weiteren Triebwerkszündungen in den folgenden beiden Tagen immer mehr zur Internationalen Raumstation auf. Am dritten Flugtag, dem 10. Juni 2011, hatte die Atlantis einen Punkt 15 Kilometer hinter der Raumstation erreicht. Für den Anflug im Rahmen des sogenannten "R-Bar Approach" musste das Space Shuttle nochmals seine Bahn senken, sodass sich die Atlantis schließlich etwa 180 Meter unterhalb der Internationalen Raumstation befand. Ab dieser Distanz übernahm Christopher Ferguson die manuelle Steuerung und flog entlang des sogenannten "R-Bar" (gedachte Verbindungslinie zwischen der Raumstation und dem Erdmittelpunkt) hinauf zur ISS. In der Nähe der Station führte Christopher Ferguson ein spektakuläres 360°-Manöver - das Rendezvous Pitch Maneuver (RPM) - durch, wobei er die Raumfähre innerhalb weniger Minuten um ihre Querachse drehen ließ. Die Besatzung der Raumstation fertigte währenddessen hochauflösende Aufnahmen des Shuttle-Hitzeschildes an. Die Aufnahmen werden später zur Erde übertragen und von Fachleuten ausgewertet. Mit einer direkt vor der ISS reduzierten Annäherungsgeschwindigkeit auf zuletzt nur noch 3 Zentimeter pro Sekunde flog der Orbiter auf den Ankopplungsstutzen der Internationalen Raumstation zu. Wie die Kommandanten bei allen Kopplungsmissionen steuerte er den Raumgleiter von der hinteren Konsole im Flugdeck aus, weil er von dort freie Sicht auf die Raumstation hatte. Ohne Probleme konnte er sein Raumschiff an die ISS ankoppeln.

Nach den üblichen Dichtigkeitsprüfungen konnten die Luken zwischen den beiden Raumschiffen geöffnet werden und die Mannschaften von STS-135 und der ISS Expedition 28 hatten Gelegenheit für eine kurze Begrüßungszeremonie.

Am vierten Flugtag holten Pilot Douglas Hurley und Missionsspezialistin Sandra Magnus von der Cupola der Internationalen Raumstation mit Hilfe des Greifarms Canadarm2 das Raffaello Multi-Purpose Logistics Module aus der Ladebucht der Atlantis. Sie befestigten es auf der erdzugewandten Seite des Harmony-Moduls der Raumstation.
Das 6,4 Meter lange und 4,6 Meter im Durchmesser betragende Raffaello war vollgepackt mit 4.265 kg Ersatzteilen und Ausrüstungsgegenständen - einschließlich 1.214 kg Lebensmittel. Damit war der weitere Betrieb der Raumstation für ein Jahr gesichert. Raffaello transportierte acht Resupply Stowage Platforms (RSPs), zwei Intermediate Stowage Platforms (ISPs), sechs Resupply Stowage Racks (RSRs) und ein Zero Stowage Rack.

Während der Kopplung von STS-135 mit der ISS unternahmen die Crewmitglieder der ISS Expedition 28, Michael Fossum und Ronald Garan, am 12. Juli 2011 (6h 31m) einen Außenbordeinsatz. Dabei erfolgte der Transport einer defekten Ammoniak-Pumpe in die Ladebucht des Space Shuttle, der Transfer des Experimentes Robotic Refueling Mission (RRM) zur Raumstation und die Befestigung an der Plattform ELC-2 für Langzeit-Untersuchungen.

Am 19. Juli 2011 koppelte die Atlantis-Besatzung mittels Federkraft wieder von der ISS ab. Dadurch werden Beschädigungen oder Verunreinigungen der Station vermieden. Erst danach wurden die Steuerungstriebwerke aktiviert und die Raumfähre entfernte sich von ihr bis zu einer Distanz von etwa 150 Meter. Von dort aus umflog Douglas Hurley die Orbitalstation eineinhalb Mal, ehe die Triebwerke der Atlantis erneut gezündet wurden und der Raumgleiter seine Distanz vergrößerte. Der Orbiter stoppte dann in einer Entfernung von etwa 75 Kilometer. Mit Hilfe des OBSS wurde eine letzte Überprüfung des Hitzeschutzschildes vorgenommen. Im Notfall hätte das Space Shuttle zur Internationalen Raumstation zurückkehren können.

Im Gegensatz zu anderen Shuttle-Flügen wurde bei dieser Mission keine weitere Raumfähre für einen möglichen Rettungsflug bereitgehalten. Für den Fall, dass eine Havarie der Atlantis eine sichere Rückkehr zur Erde unmöglich gemacht hätte, wäre die Besatzung der STS-135 vorläufig an Bord der ISS geblieben und im Laufe der folgenden Monate mit Sojus-Raumschiffen zur Erde zurückgebracht worden. Für die Auswahl der Atlantis-Besatzung bedeutete dies, dass sie auch die strengeren Anforderungen für Sojus-TMA-Missionen erfüllen musste, so wurden für sie Sokol-Raumanzüge und Sojus-Konturensitze maßgefertigt.

In der Folge wären zwei Sojus-Raumschiffe mit jeweils einem, sowie eins mit zwei freien Plätzen zur ISS gestartet. Die Besatzung von STS-135 wäre dann mit Sojus TMA-21 (Rex Walheim), Sojus TMA-02M (Christopher Ferguson), Sojus TMA-03M (Sandra Magnus) und Sojus TMA-04M (Douglas Hurley) zur Erde zurückgekehrt, sodass die vollständige Rückkehr der Besatzung bis Juni 2012 gedauert hätte.